Flora Parku Krajobrazowego Puszczy Knyszyńskiej liczy 843 gatunki roślin naczyniowych (w tym 26 gatunków paprotników, co stanowi około 38% całej flory naczyniowej Polski. Zarejestrowano także występowanie około 200 gatunków mchów i wątrobowców oraz 280 gatunków porostów. Dotychczasowy stan zbadania flory Parku oraz przyległych do niego terenów nie jest jeszcze pełny. W związku z tym można przypuszczać, że przedstawione dane liczbowe są zaniżone.
Puszcza Knyszyńska nie może pochwalić się obecnością gatunków egzotycznych czy osobliwościami występującymi jedynie tutaj. Jej fauna jest typowa dla lasów Niżu Środkowoeuropejskiego i bardzo zbliżona do fauny Puszczy Białowieskiej czy Augustowskiej.
Na terenie Puszczy stwierdzono występowanie 18 gatunków drobnych ssaków, z czego 4 to przedstawiciele owadożernych: kret Talpa eropaea, ryjówka aksamitna Sorex araneus i malutka S. minutus oraz rzęsorek rzeczek Neomys fodiens. Pozostałe należą do rzędu gryzoni i są reprezentowane przez nornicę rudą Clethrionomys glareolus, badylarkę Micromys minutus, smużkę Sicista betulina, darniówkę zwyczajną Pitymys subterraneus, nornika burego Microtus agrestis, nornika zwyczajnego (polnego) Microtus. arvalis i północnego Microtus. oeconomus, mysz polną Apodemus agrarius, mysz leśną wielkooką Apodemus flavicollis, domową Mus musculus i zaroślową Apodemus sylvaticus, szczura wędrownego Rattus norvegicus, karczownika Arvicola terrestris, koszatkę Dryomys nitedula i orzesznicę Muscardinus avellanarius. Dwa ostatnie gatunki należą do rodziny pilchowatych. Prowadzą nadrzewny tryb życia, są aktywne nocą. Zamieszkują stare drzewostany o charakterze naturalnym. W Puszczy znajdują odpowiednią bazę pokarmową (owoce, nasiona, owady) oraz dziuple. Obecność pilchowatych świadczy o wysokim stopniu naturalności środowiska Puszczy Knyszyńskiej.
Największym, a zarazem bardzo atrakcyjnym mieszkańcem Puszczy Knyszyńskiej jest żubr Bison bonasus - największy polski ssak. Założycielem obecnego stada był żubr-byk, który przywędrował tu samotnie prawdopodobnie z Puszczy Białowieskiej w 1969 roku. W 1973 roku przywieziono stamtąd 5 żubrów (2 byki i 3 krowy) i wypuszczono je na wolność na terenie Nadleśnictwa Waliły. Od tego czasu stado znacznie powiększyło swoją liczebność i aktualnie liczy około 50 sztuk.
Równie atrakcyjnym mieszkańcem Puszczy jest jeleń Cervus elaphus, charakteryzujący się tu porożem wysokiej jakości. Z innych ssaków parzystokopytnych spotkać można dzika Sus scrofa, który jest tutaj bardzo liczny, sarnę Capreolus capreolus oraz łosia Alces alces. Ten ostatni pojawił się w Puszczy niedawno jako emigrant z głównych ostoi w Polsce północno-wschodniej, przede wszystkim z Bagien Biebrzańskich. Jego liczebność nie jest wysoka.
Spośród drapieżników Puszczę zamieszkują przedstawiciele rodziny psowatych czyli wilki Canis lupus, lisy Vulpes vulpes i jenoty Nyctereutes procyonoides. Rodzinę łasicowatych reprezentują borsuki Meles meles, wydry Lutra lutra, kuny, łasice Mustela nivalis i gronostaje Mustela erminea, a kotowate - ryś Felis lynx.
Nad brzegami rzek i strumieni spotkać można piżmaki Ondatra zibethica i bobry Castor fiber, a na polach i obrzeżach lasów - zające szaraki Lepus europaeus. Podczas wycieczek do lasu widuje się zwinne wiewiórki Sciurus vulgaris, zaś w pobliżu siedzib ludzkich jeże Erinaceus europaeus.
Puszczę Knyszyńską zamieszkują również latające ssaki - nietoperze: mopek Barbastella barbastellus, mroczek późny Eptesicus serotinus, nocek łydkowłosy Myotis dasycneme, nocek rudy Myotis daubentoni, borowiec wielki Nyctalus noctyula, karlik większy Pipistrellus nathusii, karlik malutki Pipistrellus pipistrellus, gacek brunatny Plecotus auritus, mroczek posrebrzany Vespertilio murinus.